DESeq2是一种常用的差异表达基因分析工具，可用于RNA-seq数据的差异表达分析。下面是DESeq2的详细使用步骤和全部脚本示例。
文章参考
Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 | Genome Biology | Full Text (biomedcentral.com)
bioconda源对工具包的介绍：
Bioconductor - DESeq2
安装
下面是在R中安装DESeq2的详细步骤：
安装R和RStudio：
如果你还没有安装R，可以在R官方网站下载并安装最新版本的R。推荐使用RStudio作为R语言的集成开发环境。你可以在RStudio官网下载并安装适合你操作系统的版本。启动R或RStudio：
打开R或者RStudio。安装DESeq2包：
在R或RStudio的命令行中输入以下命令安装DESeq2包：if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")BiocManager::install("DESeq2")
这将会从Bioconductor仓库安装DESeq2包及其依赖项。
加载DESeq2包：
安装完成后，在R或RStudio中输入以下命令加载DESeq2包：library(DESeq2)
确保没有报错，这样DESeq2包就已经成功加载了。
安装完成后，你就可以使用DESeq2进行基因表达差异分析了。记得在分析之前准备好你的RNA-seq数据并按照DESeq2的文档或教程进行分析。
DESeq2 的完整使用步骤和示例分析脚本，以及每个步骤的输入、输出和解释。
步骤 1: 读取和整理数据
首先，加载必要的 R 包和数据文件。数据应该包括表达矩阵和样本信息。
# 读取 DESeq2 包library(DESeq2)# 读取表达矩阵countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1))# 读取样本信息sampleInfo <- read.csv("sample_info.csv")# 创建 DESeq2 数据对象dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ condition)count_matrix.csv: 包含基因或转录本的表达矩阵，行代表基因或转录本，列代表样本。sample_info.csv: 包含每个样本的信息，例如条件、分组等。 步骤 2: 数据标准化和差异表达分析
使用 DESeq2 对数据进行标准化和差异表达分析。
# 标准化数据dds <- DESeq(dds)# 进行差异表达分析res <- results(dds)步骤 3: 结果解释和可视化
对差异表达结果进行解释和可视化。
# 查看差异表达基因topGenes <- head(rownames(res[order(res$padj), ]), 10)# 输出差异表达基因write.csv(res, file = "deseq2_results.csv")# 绘制差异表达图plotCounts(dds, gene = topGenes, intgroup = "condition")deseq2_results.csv: 包含差异表达分析结果的输出文件。 解释和注意事项：
DESeqDataSetFromMatrix(): 用于创建 DESeq2 数据对象，其中 countData 是表达矩阵，sampleInfo 包含样本信息，design 参数指定实验设计。DESeq(): 对数据进行归一化和标准化，准备进行差异表达分析。results(): 提取差异表达分析的结果，包括基因表达差异统计信息。结果包括基因表达水平的差异统计指标，如 fold change、调整的 p 值（padj）等。plotCounts(): 用于绘制基因表达水平的差异示意图，以更直观地展示不同条件下基因的表达情况。 使用案例
以下是三个使用 DESeq2 工具包的案例，包括完整的脚本以及输入输出文件内容和格式的详细解释。
案例 1: 基因差异表达分析
输入文件:
count_matrix.csv: 包含基因表达计数矩阵，行代表基因，列代表样本。sample_info.csv: 包含每个样本的信息，例如条件或组别。 脚本:
# 读取 DESeq2 包library(DESeq2)# 读取表达矩阵和样本信息countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1))sampleInfo <- read.csv("sample_info.csv")# 创建 DESeq2 数据对象dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ condition)# 标准化数据和进行差异表达分析dds <- DESeq(dds)res <- results(dds)# 输出差异表达基因列表和统计信息write.csv(res, file = "deseq2_results.csv")# 绘制差异表达基因的表达图topGenes <- head(rownames(res[order(res$padj), ]), 10)plotCounts(dds, gene = topGenes, intgroup = "condition")输出文件:
deseq2_results.csv: 包含差异表达分析结果的输出文件。包括基因、fold change、p 值、调整的 p 值等信息。图形文件：包含差异表达基因的表达图，显示不同条件下基因的表达情况。 案例 2: 多组实验设计的差异分析
输入文件:
count_matrix.csvsample_info_multigroup.csv: 包含多组实验设计的样本信息。 脚本:
# 读取 DESeq2 包library(DESeq2)# 读取表达矩阵和样本信息countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1))sampleInfo <- read.csv("sample_info_multigroup.csv")# 创建 DESeq2 数据对象（多组实验设计）dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ group + condition)# 标准化数据和进行差异表达分析dds <- DESeq(dds)res <- results(dds)# 输出差异表达基因列表和统计信息write.csv(res, file = "deseq2_results_multigroup.csv")输出文件:
deseq2_results_multigroup.csv: 包含多组实验设计差异表达分析结果的输出文件。 | gene_id | baseMean | log2FoldChange | lfcSE | stat | pvalue | padj |
| GeneA | 100 | 1.5 | 0.2 | 7.2 | 0.0001 | 0.001 |
| GeneB | 80 | -0.8 | 0.3 | -4.5 | 0.0002 | 0.002 |
| GeneC | 50 | 2.1 | 0.5 | 6 | 0.0003 | 0.003 |
gene_id: 基因或转录本的标识符。baseMean: 平均表达量。log2FoldChange: 对数变换后的 fold change，表示在不同条件之间的表达倍数变化。lfcSE: log2 fold change 的标准误差。stat: 统计检验值。pvalue: 未经校正的 p 值。padj: 经过多重假设检验校正后的调整 p 值（通常使用 FDR 校正），用于控制假阳性发现率。 案例 3: 时间序列分析
输入文件:
count_matrix_timeseries.csv: 包含时间序列实验的基因表达计数矩阵。 | GeneID | Sample1 | Sample2 | Sample3 | Sample4 |
| GeneA | 10 | 15 | 20 | 25 |
| GeneB | 5 | 8 | 12 | 18 |
| GeneC | 30 | 35 | 40 | 45 |
| ... |
sample_info_timeseries.csv: 包含时间序列实验的样本信息，包括时间点等信息。 | Sample | TimePoint | Treatment |
| Sample1 | 0 | Control |
| Sample2 | 3 | DrugA |
| Sample3 | 6 | DrugA |
| Sample4 | 9 | Control |
| ... |
脚本:
# 读取 DESeq2 包library(DESeq2)# 读取表达矩阵和样本信息countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix_timeseries.csv", row.names = 1))sampleInfo <- read.csv("sample_info_timeseries.csv")# 创建 DESeq2 数据对象（时间序列实验设计）dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ time_point)# 标准化数据和进行差异表达分析dds <- DESeq(dds)res <- results(dds)# 输出差异表达基因列表和统计信息write.csv(res, file = "deseq2_results_timeseries.csv")输出文件:
deseq2_results_timeseries.csv: 包含时间序列实验差异表达分析结果的输出文件。 DESeq2分析结果进行差异表达火山图的绘制
DESeq2 的结果文件 deseq2_results.csv，文件的格式类似于：
| gene_id | baseMean | log2FoldChange | lfcSE | stat | pvalue | padj |
| GeneA | 100 | 1.5 | 0.2 | 7.2 | 0.0001 | 0.001 |
| GeneB | 80 | -0.8 | 0.3 | -4.5 | 0.0002 | 0.002 |
| GeneC | 50 | 2.1 | 0.5 | 6 | 0.0003 | 0.003 |
使用 R 语言和 ggplot2 库来绘制火山图的示例代码：
# 导入必要的库library(ggplot2)library(dplyr) # 用于数据处理# 读取差异表达结果文件results <- read.csv("deseq2_results.csv")# 设定显著性阈值（例如，调整的 p 值）threshold <- 0.05# 根据显著性阈值筛选差异表达基因significant_genes <- results %>% filter(padj < threshold)# 绘制火山图ggplot(results, aes(x = log2FoldChange, y = -log10(padj), color = ifelse(padj < threshold, "red", "black"))) + geom_point(size = 1.5) + scale_color_manual(values = c("black", "red"), labels = c("Not significant", "Significant")) + labs(x = "log2(Fold Change)", y = "-log10(adjusted p-value)", title = "Volcano Plot of Differential Expression") + theme_minimal()这段代码将根据调整的 p 值（padj）和 fold change（log2FoldChange）绘制火山图。显著性基因将以红色标记，非显著性基因将以黑色标记。您可以调整 threshold 的值来控制显著性。
